Бета днк человека что такое
ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ
С другой стороны, существует целый ряд примеров ферментов с типичной для ДНК-полимераз β каталитической активностью, особенности структуры которых (например, исключительно высокие – до 260 кДа – величины молекулярной массы) отличаются от критериев,считающихся идентификационными.
Целью настоящего исследования является выяснение вопроса о том, имеет ли место гиперэкспрессия ДНК-полимеразы β в клетках острого миелоидного лейкоза HL-60 и если да, то каковы структурно-функциональные особенности данного фермента, как возможной мишени для воздействия ингибиторами-цитостатиками.
Материал и методы
Выделение хроматина.
Гель фильтрация. Лиофилизированные порошки растворяли в 15 mM калий-фосфатном буфере (pH 6,30)/5,0 mM MgCl2/1,5 mM ЭДТА/0,0001% азида натрия и пропускали через фиброглассовые фильтры с диаметром пор 0,3–0,4 μ (Millipore 5R, Millipore, США). Прозрачные растворы подвергали ультрафильтрации на мембранах с пределом молекулярной эксклюзии, равным 25 кДа, при 800 psi (Diaflo Y25, Amicon BV, Нидерланды). К фильтратам добавляли 2-меркаптоэтанол до конечной концентрации 1,0% (v/v). Получаемые образцы концентрировали в роторном испарителе, доводя их конечный объем до 1,5–2,5 мл.
Измерение активности ДНК-полимеразы
Спектрометрия. Для оценки нативности выделенного фермента использовали стандартные версии метода сканирующей УФ-спектрофотомерии (Lambda 1050 ScanningSpectrophotometer, PerkinElmer, Inc., США) и метода спектрометрии кругового дихроизма (КД-спектрометрия) (J815 CD Spectrometer, JASCO, Inc., США). Для обработки данных использовали пакет программного обеспечения SpectraManager 2А (JASCOInc., США).
Результаты и обсуждение
Предложенная нами процедура позволяет выделить высокоочищенный 66,5 к Дамономерный белок (рис. 1), обладающий выраженной каталитической ДНК-полимеразной активностью и способный синтезировать отрезки ДНК в пределах 200–250n (рис. 1A). Выделенный высокоочищенный фермент обладает следующими свойствами: ИЭТ = 8,45 (рис. 1Б, В, Д), pH-оптимум 8,0, оптимальная концентрация иона-драйвера – 15 mM. Кинетические константы, определённые по скорости утилизациид ТТФ, равны Km = 0,016 mM, Kcat = 0,622 [мкMдТТФ/мин.] /мг белка.
УФ-спектрофотомерия выделенного фермента показывает не только отсутствие таких примесей как поли- и олигонуклеотиды, но также и подтверждает факт нативности белка [44] (рис. 2).
Высокий уровень нативности выделенного фермента и преобладание в его глобуле альфа-элементов вторичной структуры [44] видны из данных КДспектрометрии (рис. 3).
Фермент, будучи устойчивым к амфидиколину и N-этилмеламиду, чувствителен к такому ингибитору как ддТТФ. Высокая концентрация KCl (200 mM) ведет к резкому увеличению его каталитической активности (табл.).
Выводы
Таким образом, следует считать, что в клетках острого миелоидного лейкоза человека (HL-60) имеет место опухоль-специфическая гиперэкспрессия ассоциированной с хроматином β-подобной ДНК полимеразы (КФ 2.7.7.7), отличающейся от большинства известных ферментов этого типа отсутствием четвертичной структуры и большой молекулярной массой (66,5 кДа) каталитически самодостаточного мономера.
Структурно-функциональные особенности обнаруженного и выделенного фермента позволяют рассматривать его в качестве возможной молекулярной мишени для действия аффинных фармакофоров, т. е. ингибиторов, тормозящих процессы репарации ДНК в клетках опухоли.
Для полной очистки фермента была предложена оригинальная экстракционно-хроматографическая методика, включающая этапы нуклеазной обработки хроматина, фенол-хлороформной экстракции белка, ступенчатого градиента насыщения сульфатом аммония, ультрафильтрации, диализа и гель-проникающей колоночной хроматографии низкого давления.
ДНК-полимераза как регулятор иммунитета. История одного открытия из первых рук
Зеленый шарик — это хорошо!
Автор
Редакторы
Недавно мне повезло участвовать в международном исследовании, результаты которого попали на страницы Nature Immunology. Мы смогли открыть новую мутацию, приводящую к очень редкому иммунологическому синдрому; мы умудрились разобраться в молекулярной основе этого синдрома, а также открыли новый тип биологических молекул, регулирующих внутриклеточный иммунитет. Это был незабываемый опыт, которым я хочу поделиться по свежей памяти с широкой аудиторией.
Предыстория
В далеком 2006 году, в Киеве, я торжественно вставил в рамку диплом кандидата биологических наук и стал думать, как жить дальше. Вариантов на тот момент было немного — мне очень хотелось заняться иммунологией, а эта область науки требует дорогостоящего оборудования и квалифицированных коллег. Поэтому на тот момент найти хорошую лабораторию я смог только за рубежом. Кстати, в то же время я присоединился к недавно созданному молодому сайту — Биомолекула.ру (если не ошибаюсь, моя учетная запись идет под номером 35).
Итак, я получил приглашение поработать пост-доком в Вайцманновском институте (Израиль), и всё завертелось. Мне повезло: в Израиле я попал в именитую лабораторию и смог освоить самые современные методы, постепенно получив неплохую специализацию в области молекулярной иммунологии клетки. И после трех лет в земле обетованной я попал в США, где получил второй пост-док в одно из отделений Техасского университета (UT Southwestern Medical Center). Мне опять повезло: университет занимается медицинскими исследованиями, в то же время являясь действующей больницей. Это позволило постепенно объединить мои иммунологические исследования с проблемами конкретных пациентов. И хотя я сам не медик и не имею допуска к пациентам, я работаю в составе большой команды специалистов, включающей медиков, генетиков, биоинформатиков и др. Мои обязанности — исследовать молекулярными методами материалы, полученные от пациентов: как правило, это клетки крови или культуры фибробластов кожи. Ниже описан один из таких проектов, который неожиданно для всех нас перерос в нечто гораздо большее.
XLPDR — синдром, про который ничего неизвестно
Как-то раз к нам за консультацией обратились генетики. Они уже давно бились над идентификацией гена, вызывающего очень редкий синдром, названия которому даже нет по-русски, — X-linked reticulate pigmentary disorder (XLPDR). На сегодня известно только около десятка семей во всем мире, в которых отмечены случаи этого заболевания. Болеют только мальчики (болезнь классически сцеплена с Х-хромосомой), ну а девочки являются носителями без каких-либо особо заметных проявлений болезни. Синдром характеризируется пятнистой (похоже на яркие веснушки) и сухой кожей по всему телу (у большинства пациентов хронический ангидроз — с рождения нет потовых желез) и очень специфическим лицом с направленными назад волосами (рис. 1). Однако самое неприятное — помимо фенотипических признаков, у этих пациентов постоянные воспалительные процессы в легких, почках и желудочно-кишечном тракте. Ничего о природе и механизмах этой редкой болезни на момент начала работы не было известно.
Рисунок 1. Пациенты с синдромом XLPDR.
. Итак, генетики обратились к нам с просьбой изучить молекулярный механизм синдрома XLPDR. Традиционный быстрый сиквенс генома (сиквенс последовательностей только экзонов, exome sequencing) результатов не приносил, и найти мутацию относительно дешевыми методами генетикам не удавалось. Поэтому нас попросили взглянуть на проблему c точки зрения молекулярной иммунологии — мы как раз тогда только-только опубликовали похожего типа статью, где описали молекулярные изменения во внутриклеточных сигнальных путях у больных с другим редким синдромом — XLID (наследственное слабоумие, тоже сцепленное с Х-хромосомой и тоже проявляющееся только у мальчиков) [1]. То есть мы к тому времени уже имели опыт иммунологических исследований реальных больных «с нуля». Кроме того, как раз двое больных с XLPDR наблюдались в нашей больнице. В общем, мы охотно ввязались в новый проект.
Надежда на быстрый успех
Поначалу дело спорилось: все клеточные линии, полученные от пациентов (фибробласты кожи и клетки крови), показывали на порядки более высокую экспрессию всей палитры иммунологических маркеров-генов. И NF-kB, и интерферон-зависимые гены экспрессировались через край без видимой на то причины. Было похоже, что у больных утратил свои функции некий важный ген-регулятор, и клеткам постоянно чудилось вторжение коварных вирусов, даже когда они росли в стерильных условиях инкубатора. Задокументировав все артефакты, мы стали дожидаться, когда генетики выяснят имя гена, который бы содержал мутацию у всех больных.
О нормальной — то есть довольно халатной — работе этого фермента и механизмах закрепления его ошибок в геноме очень доходчиво рассказывает статья «Следы полимеразы α» [2]. — Ред.
Рисунок 2. Схема гена POLA1 и мРНК у здоровых людей (а) и у больных XLPDR (б). В результате точечной замены в интроне 13 (звездочка) образуется ложный альтернативный сайт сплайсинга, и бόльшая часть пре-мРНК образует нежизнеспособную мРНК, которая быстро деградирует. Меньшая часть мРНК всё же собирается правильно, что обеспечивает выживание клеток (репликацию), однако этого количества POLA1 не хватает для выполнения альтернативных функций (см. дальше).
Первая загадка
Первая гипотеза — что больные болеют из-за неспособности лимфоцитов при инфекции быстро размножаться и подавлять инфекцию — была опровергнута простым анализом крови. Мы обнаружили, что мутация не влияет на количество иммунных клеток в крови больных, и значит, делятся они нормально. Стало быть, нарушение метаболизма происходит внутри самих клеток, и это каким-то неведомым образом провоцирует иммунный ответ.
И правда — исследовав клетки пациентов, мы нашли, что дефицит полимеразы почему-то приводит к хронической активации многих сигнальных путей. Кроме того, если с помощью специфической киРНК (siRNA) [3] снизить количество POLA1 в нормальных клетках, у них тоже начинается воспаление. Все данные указывали на то, что полимераза POLA1 каким-то образом удерживает клетки от постоянного воспалительного ответа, то есть служит негативным регулятором иммунитета. Оставалось только понять, как такое может быть.
Молекулярная рутина
Дальше пошли бесконечные эксперименты с использованием всего оборудования, до которого мы могли дотянуться. С помощью микроскопии мы обнаружили, что значительная часть белка POLA1 находится в цитоплазме, что для ДНК-зависимой ДНК-полимеразы, опять же, довольно необычно. Тогда мы (вполне оправданно) стали искать точки соприкосновения POLA1 с другими известными цитоплазматическими регуляторами иммунного ответа. В клетках существует целый ряд иммунных сенсоров и сигнальных путей, и большинство этих белков при активации взаимодействует друг с другом напрямую. Мы даже разработали специальный метод, упрощающий поиск таких взаимодействий [4]. Однако в случае с POLA1 ничего не сработало — полимераза напрямую не входила в состав ни одного известного сигнального пути.
Следующим маневром была попытка определить, какой именно сигнальный путь регулируется полимеразой POLA1. С помощью киРНК мы снижали концентрацию POLA1 в культурах различных нормальных клеток до уровня больных (это называется нокдаун гена) и после этого проверяли, насколько клетки становились чувствительными к тому или иному иммунному стимулу. Надо сказать, клетки человека виртуозно могут распознавать всякую заразу с помощью не одного десятка различных рецепторов, и это существенно осложняет работу. Потому мы последовательно обрабатывали клетки всеми мыслимыми лигандами для толл-подобных рецепторов (TLR; рецепторы заражения, которых у человека с десяток, и каждый «чувствует» присутствие определенного типа бактерий или грибов).
Также мы стимулировали клетки интерлейкином-1 и TNF (универсальными воспалительными факторами, из-за которых у человека повышается температура и наступает болезненная усталость), а также имитировали вирусное заражение (что активирует внутриклеточные ДНК- и РНК-сенсоры, например, RIG-I, MAVS, STING). Логично было предположить, что если определенный сигнальный путь связан с POLA1, клетка с искусственным нокдауном POLA1 должна становиться гиперчувствительной только к определенному лиганду, а действие остальных стимулов не должно особо отличаться от контроля. Однако нас снова ожидал сюрприз: при нокдауне POLA1 большинство клеток приобретало гиперчувствительность ко всем стимулам сразу. Получалось чёрт-те что: никто из нас не слышал о существовании таких глобальных регуляторов всего иммунитета, а главное — мы до сих пор так и не поняли механизм.
Тут у нас закрались серьезные подозрения — вдруг мы прозевали какой-то очевидный фактор, который вызывает такой артефакт? Чтоб исключить возможные влияния на эксперимент наших биополей, барабашек и прочих потусторонних сил, мы обратились в несколько лабораторий с просьбой повторить ключевые опыты. Но все результаты подтвердились независимо от фазы Луны и месторасположения лабораторий. Стало ясно, что мы поймали нечто большее, чем просто мутацию.
Путь во тьме
Приблизиться к раскрытию механизма нам помогла случайность. В описанных выше экспериментах с киРНК мы заметили, что нокдаун POLA1 в одной из самых популярных лабораторных линий клеток — карциномы почки, НЕК293 — не вызывал ожидаемого воспаления. На тот момент мы просто отметили это и переключились на другие линии. Однако теперь мы вспомнили, почему клетки НЕК293 — одна из самых популярных лабораторных клеточных линий: они очень легко трансфецируются любой ДНК. А это происходит в частности из-за того, что в НЕК293 из-за ряда мутаций почти полностью отсутствуют внутренние антивирусные сенсоры, которые узнают проникшие в клетку вирусные молекулы РНК и ДНК. То, что именно эта клеточная линия оказалась единственной невосприимчивой системой к перепадам количества POLA1, дало нам решающую подсказку: наблюдаемый эффект каким-то образом должен быть связан с концентрацией нуклеиновых кислот в цитоплазме и способностью клетки различать нуклеиновые кислоты в цитоплазме по принципу «свой–чужой».
Известно, что клетки очень тщательно контролируют количество нуклеиновых кислот в цитоплазме. При инфекции вирусы впрыскивают свою ДНК (или РНК) внутрь клеток, и клеточные сенсоры распознают чужеродные нуклеиновые кислоты по целому ряду особенностей. При обнаружении чужеродной ДНК/РНК активируется интерфероновая защита — основа антивирусного ответа. Этот процесс включает арест метаболизма (чтобы вирусные частицы не успели собраться), секрецию интерферонов (оповещение соседних клеток и иммунной системы о заражении) и деградацию внутри клеток всего, что выглядит подозрительным (генеральная уборка, назовем это так). И то, что мы видели у клеточных линий больных с нашим синдромом, очень напоминало именно антивирусный ответ — с одной только разницей: клетки находились в стерильных условиях и вирусами не инфицировались.
Теперь, если соединить воедино всё, что мы знали о синдроме, картина наполнялась новым смыслом:
В целом всё указывало на то, что POLA1 каким-то образом уменьшает количество вирусной или собственной (например, ретротранспозонной) РНК или ДНК в цитоплазме. А если POLA1 отсутствует, то «мусорные» нуклеиновые кислоты накапливаются в цитоплазме и хронически активируют антивирусные сигнальные пути, что ведет к постоянному воспалению, которое мы видим у больных.
Это всё логично, но хотелось всё-таки понять механизм работы POLA1. Она не может напрямую уничтожать мусорную ДНК (как это делает ряд ферментов — например, TREX1 [8]), потому что POLA1 — одна из немногих полимераз с неактивным экзонуклеазным доменом. Кроме того, мы должны были научиться определять количество нуклеиновых кислот в цитоплазме, поскольку существующие методы — микроскопия или проточная цитометрия с использованием специфических антител к ДНК — работали на наших моделях из рук вон плохо, ведь нас интересовала только цитоплазма, а ядро, полное нуклеиновых кислот, неизменно давало очень высокий фоновый сигнал.
Сказка о потерянном времени
Параллельно возникла еще одна проблема: ввиду «горячей» информации (ведь на тот момент самым главным, что мы открыли, была мутация в гене POLA1) и большого количества соавторов, нас постоянно торопили с публикацией того, что есть — иначе любой другой генетик мог случайно наткнуться на интересную мутацию и опубликовать статью, тем самым нивелировав ценность наших изысканий.
Мы начали ощущать неслабое давление — мол, давайте не гнаться за топовыми журналами, опубликуем что есть в средненьком генетическом издании, а позже спокойно найдем механизм и опубликуем еще раз, тоже в хорошем молекулярном журнале. Нам (мне и моему руководителю) пришлось проявить недюжинные политические качества, убеждая коллабораторов в том, что мы почти закончили и что волноваться не стоит, и еще у нас есть парабеллум. Однако настроения это не поднимало — мы действительно не знали, с какой стороны подойти к механизму, а время всё утекало. Каждый новый вариант проверки требовал двух-трех месяцев напряженной работы, и у нас оставалось максимум две-три попытки до того момента, как коллабораторы потеряют последнее терпение.
Зеленый свет
Пасьянс сложился как-то вдруг. У нас уже был под рукой полный набор антител к нуклеиновым кислотам: к двух- и одноцепочечной ДНК, а также к РНК:ДНК-гибридным молекулам. Антитела работали неплохо, но мы не могли придумать нормального метода регистрации. И вдруг нас осенило: если цитоплазматическую фракцию клеток отделить от ядер (это легко), то тогда с помощью антител можно очистить именно цитоплазматические ДНК или ДНК:РНК. А если антитела прикрепить к сефарозным шарикам (Protein-G agarose beads — реактив, который традиционно используют в лабораториях для аффинной хроматографии), то эти шарики можно просто окрасить специфическим красителем для нуклеиновых кислот (с изобретением qPCR таких красителей продается много, и мы выбрали PicoGreen, потому что он зеленый и красивый), а потом сравнить уровни свечения под обычным микроскопом с ультрафиолетовой лампой.
Значит, если в цитоплазме много молекул ДНК или РНК:ДНК, шарики будут светиться ярко-зеленым, а если мало — то бледно-зеленым. Быстро обкатав методику, мы начали сравнивать цитоплазму в различных здоровых клетках и в клетках наших пациентов с синдромом XLRPD.
Первый же эксперимент поразил нас: у здоровых клеток в цитоплазме оказалось очень-очень много цитоплазматической РНК:ДНК. В цитоплазме же клеток наших больных РНК:ДНК-молекул не было практически совсем (рис. 3)! Ровно противоположный результат тому, что мы ожидали. Однако нас уже было не остановить.
Рисунок 3. Типичный результат анализа цитоплазматической РНК:ДНК в различных моделях клеток. а — Индивидуальные зерна сорбента с иммобилизированными РНК:ДНК-антителами (RNA:DNA) или неспецифическими контрольными антителами (IgG). Сравниваются три типа клеток — HEK293 и HeLa с POLA1-нокдауном, а также фибробласты здоровых людей и пациентов с XLPDR. Числа под картинками — относительная флуоресценция. б — Зерна сорбента при меньшем увеличении показывают сравнительное количество РНК:ДНК в цитоплазме пациентов с XLPDR и в тех же клетках после добавления в геном здоровой копии гена POLA1. Числа — относительная флуоресценция: как видно, разница более чем десятикратная.
Убедившись, что главное различие между здоровой клеткой и клеткой с дефицитом POLA1 — это загадочная РНК:ДНК в цитоплазме, мы в который раз с запозданием хлопнули себя по лбу. Ведь что гласит университетский курс по молекулярной биологии: фрагмент Оказаки — основной продукт POLA1 — представляет собой небольшую РНК-затравку, к которой полимераза добавляет ДНК-нуклеотиды. Получается, что POLA1 в свободное от репликации время синтезирует подобные РНК:ДНК-комплексы в цитоплазме.
Мы попробовали очистить эти цитоплазматические химеры и трансфецировать их в клетки больных синдромом XLPDR. Действительно, после этого воспаление на время пропадало. А значит, POLA1 постоянно синтезирует некие иммунологически инертные РНК:ДНК-комплексы (размером около 100 пар нуклеотидов), которые служат неким «белым шумом», не давая цитоплазматическим сенсорам перевозбуждаться из-за незначительных утечек нуклеиновых кислот, например, из ядра или при повреждении митохондрий. И только когда концентрация подозрительной ДНК превышает уровень шума, вся антивирусная система и запускается. По всему выходило, что задача POLA1 — постоянно производить «нуклеиновый шум», чтобы не допускать ложного срабатывания интерферонового ответа.
Публикация, в натуре
Мы сделали это! Обычно в сказках и в подростковых фильмах на этом месте начинаются титры, и герои уходят в даль, на закат. Увы, в реальности так элегантно не получается.
Во-первых, большинство было настроено скептически относительно публикации в топовом журнале — конкуренция там огромная, и любая даже очень хорошая статья может застрять на этапе рецензии на многие месяцы. Во-вторых, написать и оформить статью под подачу в каждый журнал занимает около месяца. А писать, естественно, приходилось нам самим — несмотря на обилие соавторов, реальную помощь оказывали единицы.
Мы начали по старшинству: август 2015 года — Science. Ответ через две недели — нет. Сентябрь 2015 — переписанная статья пошла в Nature. Ответ через полторы недели — нет. Октябрь 2015 — Nature Immunology, статья снова переписана и рисунки переделаны. И вдруг нам улыбнулась удача — ответ редактора пришел почти сразу: «Мне нравится, но давайте посмотрим, что скажут рецензенты». Через неделю все три рецензента ответили одинаково — будем брать. А дальше события развивались фантастически быстро: ответить на основные замечания у нас заняло всего месяц — почти все комментарии были по делу, и бόльшая часть материала у нас уже была на руках (мы его не включали в статью по причине экономии места, ведь объем текста и рисунков жестко регламентирован). Переделанная версия была отправлена на суд рецензентов, и позитивный ответ мы получили уже на следующий день. После трех лет работы над проектом это была поистине королевская награда [9]!
По-вашему, это финал?
Конечно, наша идея про РНК:ДНК-дуплексы в роли «нуклеинового шума» пока что только рабочая гипотеза. Мы до сих пор не смогли определить последовательность нуклеотидов в этих дуплексах, поэтому не представляем их источника и мишеней внутри клеток. Идея про «нуклеиновый шум» хоть и элегантна, но тоже еще не доказана. И в целом, вопросов на данный момент больше, чем ответов. Но одним из результатов этой работы всё-таки уже можно гордиться: мы теперь можем генотипировать сестер больных ребят — чтобы определить, являются ли они носителями мутации или могут не опасаться иметь детей в будущем. И мы наконец смогли рассказать десяти больным, почему они больны и что с ними не так, и теперь можем подсказать их лечащим врачам, в какую сторону следует корректировать их метаболизм. Потому что это ужасно — знать, что у тебя редкая болезнь, о которой известно одно лишь название. Да и то — до сих пор не переведенное на русский.
Отряд самоубийц в медицине
Отряд самоубийц в медицине
Необратимый ингибитор (оранжевый), подобно диверсанту, подрывает работу фермента (синий). Это потенциальное лекарство против трипаносомы крузи — главной причины болезни сердца в Латинской Америке.
Авторы
Редакторы
Статья на конкурс «био/мол/текст»: Многие лекарства конкурируют с природными молекулами за связывание со своей мишенью. Большинство таких препаратов связывается с белками за счет слабых взаимодействий, но некоторые способны образовывать прочные связи, «выключая» свою мишень до конца ее «жизни», пусть и ценой собственной. Такие лекарства относятся к классу необратимых ковалентных ингибиторов, получивших образное название суицидных ингибиторов (англ. suicide inhibitors). О них и пойдет речь в нашей статье. Как работают и насколько опасны одни из самых эффективных лекарств? Чья болезнь помогла открыть аспирин? Что общего между никотином и грейпфрутовым соком? Ответы на эти и многие другие вопросы вы найдете далее.
Конкурс «био/мол/текст»-2017
Эта работа опубликована в номинации «Свободная тема» конкурса «био/мол/текст»-2017.
Генеральный спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Спонсором приза зрительских симпатий и партнером номинации «Биомедицина сегодня и завтра» выступила фирма «Инвитро».
Из чего же, из чего же сделаны эти лекарства?
Сегодня сложно представить себе человека, который ни разу в жизни не принял ни одной таблетки. Каждый год прилавки аптек пополняются все новыми и новыми лекарствами. Независимо от цвета упаковки препарата и его лекарственной формы (будь то таблетка, мазь, капсула, раствор для инъекций и т.д.) внутри всегда содержится главный компонент лекарства — действующее вещество. Именно оно и обеспечивает терапевтический эффект.
Большинство действующих веществ является ингибиторами, то есть они блокируют функцию того или иного белка (чаще фермента, но иногда и рецептора) в нашем или чужеродном организме. Многие из них связываются со своей мишенью обратимо, то есть после встраивания в мишень молекула может выйти обратно, так что их возможности сильно ограничены. Но необратимые ковалентные ингибиторы «намертво» связываются со своей мишенью. В результате фермент больше не способен функционировать до тех пор, пока клетка не синтезирует его новые копии.
Низкомолекулярные «взломщики»
«В чем же секрет столь сильного связывания этих ваших необратимых ингибиторов?» — спросите вы. В ковалентной связи. Существует несколько механизмов связывания лекарств с их молекулярными мишенями. Обычно связывание происходит при помощи слабых взаимодействий [4]. Ковалентная же связь является сильнейшим из возможных взаимодействий и превосходит любые другие в десятки, а то и сотни раз (табл.1) [5]!
| Тип связи | Энергия, ккал/моль |
|---|---|
| Ковалентная | 50–150 |
| Электростатическая | 5–10 |
| Водородная | 2–5 |
| Гидрофобная | 0,5–1 |
Механизм образования ковалентной связи строится на том, что пара электронов одного из атомов молекулярной мишени (нуклеофила) распределяется между ним и одним из атомов ингибитора (электрофилом) (рис. 1). Из-за высокой прочности связи ингибитор оказывается необратимо присоединен к ферменту и приводит к разрушению последнего. Восстановление функции фермента наступает только после синтеза его новых копий [5].
Рисунок 1. Общий механизм действия необратимых ингибиторов.
Как же выглядят эти электрофильные группы, которые используются для создания ковалентных необратимых ингибиторов? Найти ответ вы сможете, посмотрев на рисунок 2. Наличие одного из этих фрагментов в структуре лекарства может говорить о том, что оно действует по уже известному вам механизму [6].
Рисунок 2. Примеры электрофильных групп, встречающихся в необратимых ингибиторах.
Несмотря на то, что связывание необратимых ингибиторов приводит к гибели фермента, не следует думать, что одна доза такого лекарства может полностью уничтожить фермент в организме. Наличие и работа генов позволит создать его новые копии, пусть на это и понадобится от нескольких часов до пары дней [2].
Как и все в мире, ковалентные необратимые ингибиторы имеют свои преимущества и недостатки, которые мы представили в формате таблицы 2 [6].
| Преимущества | Недостатки |
|---|---|
| Высокие эффективность и избирательность позволяют использовать меньшие дозы и уменьшить риск побочных эффектов | Высокая активность некоторых представителей может приводить к некрозу печени, мутациям и даже раку! |
| Связывание с важными остатками фермента предотвращает развитие устойчивости микробов, что важно при лечении инфекций | Потенциальная иммуногенность, так как полученный продукт реакции может вызывать аллергический ответ |
| Длительное действие, так как активность фермента вновь появляется только при синтезе его новых копий |
Тернистые пути разработки эффективных лекарств
Если вы думаете, что разработка необратимых ковалентных ингибиторов — легкое дело, то вы глубоко заблуждаетесь. Даже если закрыть глаза на то, что разработка любого лекарства является крайне трудоемким и времязатратным процессом [7], задача не сильно упростится — ведь необратимые ингибиторы требуют особого подхода к своей персоне. Сегодня не так много одобренных препаратов действуют именно таким образом. А механизм действия многих из них открыли только спустя годы после разработки! Ученые на этом пути сталкиваются с большим количеством порой неразрешимых проблем.
Одна из них — участие одного фермента сразу в нескольких метаболических каскадах. Обсуждаемые лекарства необратимо связываются с ферментом-мишенью, уничтожая его на то время, которое требуется на синтез новых копий фермента. Этот процесс может занимать до нескольких суток! В том случае, если фермент-мишень выполнял несколько функций, это чревато серьезными побочными эффектами. Чтобы обойти проблему, необратимо связывающиеся ингибиторы чаще всего применяют для блокирования одного из ферментов потенциально опасных для человека вирусов, бактерий и т. д. [3].
Вторая проблема заключается в том, что при низкой избирательности необратимые ингибиторы могут связываться с нежелательными мишенями, похожими на выбранную нами для ингибирования. Это тоже может приводить к серьезным побочным эффектам. Поэтому важная задача при оптимизации структуры ингибиторов — повышение избирательности к своей мишени [3].
Опасения в отношении побочных эффектов необратимых ингибиторов не лишены оснований. Бум гонений на эту группу препаратов вызвали исследования 1970-х годов. Тогда выяснили, что два из наиболее широко известных представителей этой группы — парацетамол и фуросемид — обладают высокой токсичностью в связи с тем, что, метаболизируясь в печени, они образовывают активные производные, формирующие ковалентные связи с ее белками [2], [8]. Как выяснилось позже, эти единичные случаи не имеют отношения ко многим препаратам из группы необратимых ингибиторов, а парацетамол и фуросемид до сих пор активно используются в клинической практике.
Другим распространенным примером нежелательного необратимого ингибирования является цитохром P450. Цитохромы — группа ферментов в нашем организме, главной задачей которых является обезвреживание потенциально опасных веществ. Первыми необратимыми ингибиторами цитохрома стали алкены и алкины. В результате ингибирования этого фермента процессы детоксикации становятся невозможными. Неполный список препаратов, способных вступать в подобную реакцию, включает 17α-алкенил-стероиды, левомицетин, циклофосфамид, спиронолактон, фурокумарины, никотин, изониазид и барбитураты. Звучит опасно, не правда ли? Не многим опаснее, чем пить грейпфрутовый сок! Его компоненты способны необратимо связываться с цитохромом кишечника и лишать этот фермент активности на 24 часа! К чему это может привести? К тому, что принимаемые в это время лекарства будут более эффективно поступать в наш организм, а рост их концентрации повышает риск развития нежелательных эффектов [5]. Именно поэтому врачи рекомендуют запивать таблетки только водой.
Но всегда ли можно считать необратимые ингибиторы безопасными лекарствами? Конечно же, нет. Поиск необратимых ингибиторов, и правда, не всегда оборачивается успехом для исследователей. В частности, полным провалом завершились исследования мышьяк-содержащих органических соединений для лечения трипаносомоза [9]. Эти соединения необратимо ингибировали жизненно необходимые ферменты трипаносомы за счет образования связей между атомом мышьяка в составе исследуемых веществ и серосодержащими остатками фермента. Но они оказались токсичными не только для трипаносомы, но и для организма человека [5].
К счастью, несмотря на все перипетии судьбы, ученые вновь сфокусировали свои пристальные взгляды на необратимых ковалентных ингибиторах. Лучшее понимание реально существующих рисков и знание механизма химических преобразований открыли множество возможностей для разработки более эффективных лекарств и привели к резкому росту встречаемости необратимых ингибиторов в различных исследованиях [10].
«Ветераны» борьбы за здоровье человечества
Многие из широко применяемых успешных препаратов — необратимые ковалентные ингибиторы [6]. Например, в 2009 году три необратимо связывающихся ингибитора попали в топ-10 наиболее продаваемых лекарств [2]. В 2011 году из 39 ковалентных лекарств, одобренных в США, 33% являлись противоинфекционными, 20% нашли применение в лечении рака, 15% применялись при болезнях пищеварительного тракта, 10% — при нарушении работы центральной нервной системы, 5% использовались при лечении сердечно-сосудистых заболеваний и один препарат обладал противовоспалительными свойствами (рис. 3) [6], [11].
Рисунок 3. Области применения одобренных в США необратимо связывающихся ингибиторов (данные за 2011 год).
Рисунок 4. Структура салицилата натрия (а) и аспирина (б).
Давайте же поговорим о нескольких наиболее успешных примерах необратимых ковалентных ингибиторов.
Натрия салицилат впервые применили в качестве противовоспалительного лекарства в 1875 году (рис. 4а). Препарат обладал ужасным вкусом и вызывал язвы ротовой полости и желудка. В конце XIX века отец одного из химиков компании Bayer Company, страдающий от тяжелого ревматоидного артрита, упросил своего сына, Феликса Хоффмана, заняться поиском менее опасного аналога салицилата натрия. Феликс синтезировал различные производные и обнаружил, что ацетилсалициловая кислота обладает лучшими свойствами. Так был обнаружен аспирин (рис. 4б). В 1899 году Bayer выпустила аспирин как противовоспалительное, обезболивающее и жаропонижающее средство [2]. Как и в случае многих других препаратов, механизм его действия открыли только спустя 70 лет после коммерциализации препарата [6], за что в 1982 году была вручена Нобелевская премия [2], [12]. Аспирин оказался необратимым ингибитором ферментов, участвующих в реакции воспаления — циклооксигеназ [6].
Рисунок 5. Структура пенициллина.
Другие примеры необратимых ковалентных ингибиторов — пенициллины [6]. Их родоначальника, пенициллин (рис. 5), открыл в 1928 году Александр Флеминг [13]. Ученым понадобилось еще 15 лет, чтобы достаточно изучить и начать использовать этот препарат в качестве антибактериального лекарственного средства, что спасло миллионы жизней во время Второй мировой войны [12]. Пенициллин нарушает синтез клеточной стенки бактерий. Он связывается с транспептидазой — ферментом, обеспечивающим первый этап сшивки пептидогликана, который является основным компонентом бактериальной клеточной стенки. Когда пенициллин связывается с транспептидазой, синтез бактериальной клеточной стенки блокируется, и многие бактерии погибают от разрыва клеточной мембраны под воздействием осмотического давления [1].
Однако все оказалось не так радужно — у бактерий обнаружились механизмы устойчивости [14]. В частности, резистентность к пенициллинам обеспечивается за счет наличия β-лактамаз — ферментов, расщепляющих пенициллины. Ученые не остановились на достигнутом и разработали ингибиторы этого фермента — сульбактам, тазобактам и клавулановую кислоту. Подобно пенициллинам, в результате нуклеофильной атаки эти соединения претерпевают открытие β-лактамного кольца. Отличие в том, что ингибиторы β-лактамаз подвергаются раскрытию и второго цикла, содержащегося в их структуре. При этом появляется возможность образования дополнительных связей, в том числе и ковалентных (рис. 6) [6], [15].
Рисунок 6. Механизм действия ингибиторов β-лактамаз
Рисунок 7. Структура ацикловира.
Ацикловир — один из самых эффективных препаратов с противовирусной активностью (рис. 7). Он был открыт в 1974 году крупной ныне фармацевтической компанией — GlaxoSmithKline (тогда она называлась Burroughs Wellcome) — в ходе широкомасштабного поиска противовирусного средства, начавшегося еще в 1960-е годы. А в 1988 году за изучение механизмов действия ацикловира и других препаратов вручили Нобелевскую премию [16].
В клинической практике ацикловир применяют для лечения вируса герпеса. Важно, что здоровые клетки человека не подвергаются действию препарата. Ведь ацикловир попадает в клетку благодаря одному из ферментов вируса — тимидинкиназе! Способность ацикловира связываться с этим ферментом в 200 раз выше, чем с любым ферментом нашего организма. Оказавшись в зараженных клетках, ацикловир преобразуется в ацикловир трифосфат, который связывается с вирусной ДНК и в таком виде необратимо ингибирует вирусные ДНК-полимеразы, необходимые для размножения вируса [17].
Другим широко известным примером необратимых ингибиторов является омепразол, одобренный к применению в 1980-х. Его применяют при заболеваниях пищеварительной системы, сопровождающихся усиленным выделением желудочной кислоты, таких как изжога или язва желудка. В нейтральной среде омепразол не оказывает действия на наш организм, но при ее закислении желудочным соком необратимо связывается с протонной помпой, ответственной за образование кислоты в желудке. Это происходит потому, что благодаря кислой среде омепразол претерпевает ряд внутримолекулярных перестроек и становится способным принять на себя нуклеофильную атаку каталитического цистеина протонной помпы, тем самым образуя прочную ковалентную связь и выключая этот белок (рис. 8) [6], [18], [19].
Рисунок 8. Механизм действия омепразола.
Африканская сонная болезнь, или африканский трипаносомоз, вызывается простейшими рода трипаносома. До конца XX века эта болезнь была практически неизлечима. Вакцины оказались неэффективны против трипаносом из-за того, что последние имеют механизмы обхода иммунной системы человека. Поэтому, основываясь на знаниях о жизненно необходимых ферментах этих простейших, ученые прибегли к разработке механизм-опосредованно связывающихся ингибиторов. Ахиллесовой пятой в метаболизме трипаносом оказался путь биосинтеза полиаминов, вовлеченных в процессы упаковки ДНК и в больших количествах необходимых при делении клеток. Первый этап их синтеза обеспечивает фермент орнитиндекарбоксилаза при участии вспомогательной молекулы — витамина В6. В клетках млекопитающих фермент синтезируется быстро, а у трипаносом этот процесс занимает гораздо больше времени. Именно поэтому необратимые ингибиторы орнитиндекарбоксилазы мало влияют на человеческие клетки, но крайне губительно действуют на паразита [1]. На базе этого механизма был разработан дифторметилорнитин (ДФМО). ДФМО достаточно инертен в растворе, но в результате реакции с витамином В6 приобретает способность связываться с орнитиндекарбоксилазой, которая быстро инактивируется (рис. 9). Эта реакция необратима. Таким образом ДФМО использует собственные реакции фермента для его уничтожения. Препарат показал высокую эффективность против африканской сонной болезни в клинических исследованиях и используется в настоящее время для ее лечения [1].
Рисунок 9. Комплекс производного ДФМО (голубой) с витамином В6 (зеленый) и ферментом орнитиндекарбоксилазой (серый).
А недавно ученые обнаружили, что ДФМО также может использоваться в качестве препарата против рака! Механизм действия ДФМО по отношению к раковым клеткам хорошо изучен. Так же, как и в случае лечения трипаносомоза, этот агент ингибирует действие орнитиндекарбоксилазы. Ведь, что интересно, в опухолевых клетках количество этого белка значительно выше, так как они интенсивно делятся! При инактивации орнитиндекарбоксилазы в раковых клетках падает уровень полиаминов, что нарушает правильную упаковку ДНК, в результате чего клетки перестают делиться. Этот эффект препарата называется цитостатическим. Однако если препарат применять долго, то происходит не замедление деления, а гибель раковых клеток! ДФМО сам по себе не обеспечивает достаточный противораковый эффект, но в комбинации с другими химиотерапевтическими препаратами этот компонент показал увеличение выживаемости пациентов и ускорение темпов выздоровления. Поэтому ДФМО имеет потенциал применения в качестве лекарства, предотвращающего возникновение онкологии, либо снижающего вероятность рецидива рака после удаления опухолевых клеток [20].
Есть ли будущее у необратимых ковалентных ингибиторов?
Долгие годы необратимые ингибиторы были окружены аурой скептицизма, возникшей из-за токсичности некоторых представителей этой группы, обнаруженной в 1970-е годы. Но эффективность и избирательность многих препаратов этой серии доказали, что страхи в их отношении не были оправданными. Конечно, они обладают потенциальной опасностью из-за возможности неспецифических взаимодействий и аллергических реакций, но клиническая практика показывает их незаменимость в лечении целого ряда заболеваний. Сейчас число препаратов этой группы неуклонно растет [6].
Сложность в том, что исследователь должен преследовать сразу несколько целей: повысить избирательность лекарства к ферменту-мишени и тщательно продумать механизм его действия. Но такие свойства необратимых ковалентных ингибиторов, как высокие избирательность и эффективность, высокая продолжительность действия, сниженный риск развития устойчивости к препарату, делают эту группу лекарств незаменимым инструментом в арсенале врачей и разработчиков лекарств [6].