Анф иммуноблот что это
Метод исследования с использованием человеческих эпителиальных клеток HEp-2, который позволяет обнаружить антинуклеарные антитела – один из маркеров системных заболеваний соединительной ткани.
АНФ, антиядерные антитела, антинуклеарные антитела (АНА).
Antinuclear Antibodies (ANA), Hep-2 Substrate, ANA-Hep2, Fluorescent AntiNuclear Antibody detection (FANA).
Непрямая реакция иммунофлюоресценции.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Как правильно подготовиться к исследованию?
Не курить в течение 30 минут до исследования.
Общая информация об исследовании
Определение антинуклеарного фактора (АНФ) является «золотым стандартом» выявления антинуклеарных антител (АНА) и диагностики аутоиммунных заболеваний.
Патогенез системных заболеваний соединительной ткани (СЗСТ) тесно связан с нарушениями в иммунной системе и повышенной выработкой антител к структурам собственных клеток. Аутоантитела к компонентам ядра клеток – антинуклеарные антитела – взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами и белками ядра, антигенами цитоплазмы, что проявляется воспалительными изменениями в тканях и органах, болями в суставах и мышцах, выраженным утомлением, потерей веса, кожными изменениями. АНА обнаруживаются при многих аутоиммунных заболеваниях, но наиболее характерны для системной красной волчанки (СКВ). АНА встречаются более чем у 90 % больных системными заболеваниями соединительной ткани, в настоящее время описано около 200 разновидностей, которые объединены единым названием – антинуклеарный фактор.
При определении АНФ методом непрямой флюоресценции чаще используется перевиваемая линия эпителиальных клеток аденокарциномы гортани человека НЕр-2. Клетки НЕр-2 являются очень удобным субстратом для лабораторного исследования, так как обладают крупными ядрами и на стеклах растут в один слой. АНА выявляются при связывании с внутриклеточными антигенами клеток НЕр-2.
При исследовании эпителиальные клетки НЕр-2 выращивают на стеклах, фиксируют и инкубируют с разведенной сывороткой крови пациента. После удаления избытка сыворотки клетки инкубируют с меченными флюоресцеином антителами, затем снова промывают и исследуют с помощью флюоресцентного микроскопа. При этом определяется титр антител и тип свечения. Диагностически значимым считается титр более 1:160. При обострении ревматических заболеваний он превышает 1:640, а в период ремиссии снижается до 1:160-1:320. Чем больше антител, тем выше титр. По типу свечения можно установить мишени антинуклеарных антител, что имеет важное клиническое значение и определяет тактику дальнейшего обследования пациента. Основными являются периферический, гранулярный (мелко-/крупно-), ядрышковый, центромерный и цитоплазматический типы окрашивания ядра. Каждому типу свечения присущи очень характерные признаки, которые позволяют отличить один вариант от другого.
Гомогенное (диффузное) окрашивание связано с наличием антител к двуспиральной ДНК, гистонам и характерно для СКВ и лекарственной волчанки.
Периферическое свечение обусловлено периферическим распределением хроматина в ядре, связано с антителами к ДНК и специфично для СКВ. Данный тип свечения важно дифференцировать от окрашивания ядерной мембраны, которое происходит при аутоиммунных заболеваниях печени.
Гранулярное (крапчатое, сетчатое) окрашивание встречается наиболее часто и является наименее специфичным, выявляется при многих аутоиммунных заболеваниях. Аутоантигенами в данном случае выступают нуклеопротеиновые комплексы в ядре (Sm, U1-RNP, SS-A, SS-B антигены и PCNA).
Очень высокие титры АНФ с крупногранулярным типом свечения часто указывают на смешанное заболевание соединительной ткани.
Нуклеарное (ядрышковое) окрашивание обусловлено антителообразованием к компонентам ядрышка (PHК-полимераза-1, NOR, U3RNP, PM/Scl), выявляется при склеродермии, болезни Шегрена. АНА иногда повышаются при эндокринных заболеваниях (сахарном диабете 1-го типа, тиреоидите, тиреотоксикозе, полиэндокринном синдроме), кожных заболеваниях (псориазе, пузырчатке), при беременности, после трансплантации органов и тканей, у больных на гемодиализе.
Центромерное свечение появляется при наличии антител к центромерам хромосом и характерно для формы склеродермии – CREST-синдрома.
Цитоплазматический тип свечения связан с антителами к тРНК-синтетазе, в частности к Jo-1, что характерно для дерматомиозита и полимиозита. Данный тип окрашивания также определяется при наличии антител к другим компонентам цитоплазмы при аутоиммунном гепатите, первичном билиарном циррозе.
Одновременное выявление различных типов свечения указывает на присутствие разных видов антител.
У здоровых людей может быть обнаружено мелкогранулярное свечение при низких, умеренных или высоких титрах АНА, но в норме крупнозернистые или гомогенные типы свечения не должны определяться.
В зависимости от результатов оценки типа свечения разрабатывается дальнейшая тактика лечения пациента и назначаются дополнительные исследования, уточняющие спектр АНА.
Для чего используется исследование?
Когда назначается исследование?
Что означают результаты?
Титр: Причины повышения титра АНФ на HEp-2 клетках:
Тип свечения
Для чего он характерен
Для СКВ, лекарственной волчанки, системной склеродермии, хронического активного гепатита
Для СКВ, синдрома Шегрена, смешанной болезни соединительной ткани, ревматоидного артрита
Для полимиозита/дерматомиозита, склеродермии, синдрома Шегрена, СКВ
Для CREST-синдрома (кальциноза кожи, синдрома Рейно, эзофагеальной дисфункции, склеродактилии, телеангиоэктазии)
Для дерматомиозита/полимиозита, аутоиммунного заболевания печени, первичного билиарного цирроза
Что может влиять на результат?
Кто назначает исследование?
Анф иммуноблот что это
Получить результаты
Компания «Новые Медицинские Технологии»
Диагностика аутоиммунных заболеваний и синдромов
Показания к назначению анализа: диагностика и дифференциальная диагностика системных заболеваний соединительной ткани (особенно СКВ), аутоиммунного гепатита, вирусного гепатита с аутоиммунным компонентом (индуцированным вирусами или лечебными вмешательствами), первичного билиарного цирроза, рассеянного склероза; выявление аутоиммунного компонента при различных заболеваниях, в патогенезе которых может играть роль аутоагрессия. Материал для исследования: сыворотка крови.
Для определения антинуклеарных антител используется методика непрямой иммунофлюоресценции с использованием в качестве субстрата клеток культивируемой линии Нер-2.
Использование в качестве субстрата клеток злокачественной культивируемой линии благодаря их особенностям (высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение, крупные размеры, наличие большого количества митозов) позволяет оценить различные типы свечения, характерные для присутствия в образце крови широкого спектра антител к различным антигенам, имеющих различные клинические ассоциации.
Следует иметь в виду, что часть из определяемых типов свечения является высокоспецифичной, четко ассоциирована с определенными заболеваниями и имеет вполне определенную диагностическую значимость, в особенности при выявлении в высоких титрах; однако некоторые антитела к различным антигенам могут давать сходные типы свечения, в таких случаях может требоваться дальнейшее обследование для уточнения конкретного антигена, к которому направлены аутоантитела. С другой стороны, определенный тип антител может встречаться при нескольких нозологических формах. Существуют также антитела (они встречаются редко), реагирующие исключительно с компонентами веретенного аппарата клеток; обычно они не связаны с аутоиммунными заболеваниями, и их обнаружение расценивается как ложнопозитивный, не имеющий клинических ассоциаций результат.
Все вышеперечисленные особенности обязательно отражаются в лабораторном заключении, где, помимо указания типа свечения и соответствующего ему наиболее вероятного типа антител, даются также рекомендации по трактовке результатов в смысле возможной ассоциации с конкретными нозоформами или синдромами, а также необходимые дополнительные лабораторные исследования.
ТРАКТОВКА РЕЗУЛЬТАТОВ.
У здоровых лиц моложе 60 лет следует ожидать отрицательных результатов на антитела к компонентам ядра и цитоплазмы; в низком титре (слабоположительный результат) эти антитела все же обнаруживаются у 2-3% (по некоторым данным, до 10%) практически здоровых людей, однако никогда нельзя предсказать, не разовьется ли у этих людей аутоиммунное заболевание в будущем (так, по данным некоторых авторов, антитела к ДНК начинают выявляться задолго до начала клинических проявлений СКВ, латентный период может продолжаться годами). После 60 лет частота слабоположительных результатов с возрастом постоянно растет. Клиническая значимость этих результатов остается неясной; как правило, они выявляются только в первичном (скрининговом) разведении 1:40. Исходя из этого, при выявлении положительного результата в скрининговом титре 1:40 всегда необходимо титрование, как минимум до диагностического титра 1:80. В любом случае представляется целесообразным последующее регулярное клинико-лабораторное наблюдение лиц, у которых выявлены ANA в низком титре.
ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА Положительный результат предполагает наличие определенных заболеваний (см. ниже), однако, как и результат любых лабораторных исследований, может нуждаться в подтверждении или уточнении с помощью других методов, а также в установлении клинико-лабораторных корреляций.
Надо иметь в виду, что различные лекарственные препараты могут вызывать образование аутоантител (гидралазин, прокаинамид, фенитоин, карбамазепин, изониазид, хлорпромазин, пеницилламин, леводофа, пенициллин, фенилбутазон, пероральные контрацептивы, хинидин). Наиболее частыми мишенями для этих ятрогенных аутоантител являются ядерные гистоны, что приводит к развитию гомогенного или гомогенного периферического типа свечения.
ЗАБОЛЕВАНИЯ, ПРИ КОТОРЫХ ЧАЩЕ ВСЕГО ВЫЯВЛЯЮТСЯ
АНА ИЛИ АНТИЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА
— системная красная волчанка (СКВ),
— ревматоидный артрит,
— синдром Шегрена,
— склеродермия,
— дерматомиозит,
— узелковый периартериит и др.;
Антинуклеарные антитела также могут выявляться при острых и хронических лейкозах, приобретенной гемолитической анемии, болезни Вальденстрема, малярии, хронической почечной недостаточности, тромбоцитопениях, лимфопролиферативных заболеваниях, миастении и тимомах.
Анф иммуноблот что это
Иммуноблот антифосфолипидных антител – иммунологическое исследование, позволяющее в одном лабораторном тесте провести анализ на несколько аутоантител, ассоциированных с развитием антифосфолипидного синдрома.
APS Immunoblotting, Antiphospholipid Antibodies Assay, Western Blot Analysis for the detection of Antiphospholipid Syndrome.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Как правильно подготовиться к исследованию?
Общая информация об исследовании
Антифосфолипидный синдром – аутоиммунное заболевание, клинически характеризующееся артериальными и венозными тромбозами, акушерской патологией (прежде всего – привычное невынашивание беременности в I и II триместрах и преждевременные роды), тромбоцитопенией и связанное с циркуляцией в крови антифисфолипидных антител.
Антифосфолипидные антитела не только являются лабораторным маркером АФС, но и играют ведущую роль в патогенезе его клинических проявлений. АФЛА обладают способностью воздействовать на процессы, составляющие основу регуляции системы свертывания крови, сдвигая равновесие в ней в сторону гиперкоагуляции – то есть тромбообразования. Процесс тромбообразования включает взаимодействие АФЛА с фосфолипидами мембран тромбоцитов, эндотелия (клеток, выстилающих изнутри кровеносные сосуды) и связанными с фосфолипидами плазменными белками. При АФС потенциально могут поражаться сосуды любого калибра – от капиллярного русла до крупных артерий, что обуславливает чрезвычайно разнообразный спектр клинических проявлений заболевания.
Антифосфолипидные антитела представляют собой семейство иммуноглобулинов разных классов (IgA, IgM и IgG), которые распознают определенные участки молекул фосфолипидов. Однако, согласно последним исследованиям, выяснилось, что главными мишенями АФЛА являются не сами фосфолипиды, а связывающиеся с ними белки плазмы, так называемые кофакторы. Комплекс кофактор-фосфолипид формирует новую молекулярную последовательность, к которой вырабатываются специфические антитела.
Таким образом, АФЛА реагируют с гетерогенной группой фосфолипидов и белковых антигенов плазмы крови, к которым относятся:
Повышенный риск развития инфаркта миокарда на фоне АФС был подтвержден после обнаружения в спектре АФЛА антител к окисленным липопротеинам низкой плотности, играющих ведущую роль в патогенезе атеросклероза.
Используемые в настоящее время диагностические критерии антифосфолипидного синдрома, принятые в 2006 году в Сиднее, помимо двух клинических параметров (тромбозы и акушерская патология), включают также три лабораторных признака – волчаночный антикоагулянт (определяется в фосфолипид-зависимых тестах на свертывание крови), а также антитела к кардиолипину и антитела к β2-гликопротеину I классов IgM и IgG, определяемые методом иммуноферментного анализа.
Антитела к кардиолипину являются основной фракцией АФЛА, их присутствие обычно ассоциировано с развитием тромбозов и тромбоцитопений. Выявление повышенного титра антител к кардиолипину на фоне клинической картины тромбозов является основанием для постановки диагноза «АФС».
Антитела к β2-гликопротеину I. β2-гликопротеин I – белок сыворотки, обладающий естественной антикоагулянтной активностью. Циркулирующие АФЛА распознают антигенные структуры, формирующиеся при взаимодействии β2-гликопротеина I и кардиолипина. Антитела к кардиолипину и β2-гликопротеину I чаще обнаруживаются у пациентов с первичной формой АФС, а в клинической картине у них преобладают тромбозы глубоких вен и эмболия легочной артерии.
Несмотря на высокую специфичность, применение для диагностики АФС только этих лабораторных критериев не всегда достаточно – тесты могут быть отрицательными при наличии клинических проявлений антифосфолипидного синдрома. Поэтому при наличии у пациента симптомов АФС и отрицательных результатах критериальных лабораторных параметров дополнительно используют определение антител к другим фосфолипидам) и кофакторным белкам.
Антитела к аннексину V. Роль аннексина V особенно важна для предотвращения тромбообразования в сосудах плаценты. Этот блок представлен во многих тканях, но в основном на эндотелиальных клетках и в плаценте. Аннексин V играет роль в предотвращении свертывания крови, конкурируя с протромбином (фактор свертывания крови) за связывание с фосфатидилсерином на оболочке клеток эндотелия и трофобласта. Молекулы аннексина V формируют блокирующий слой, и на поверхности трофобласта не происходит тромбообразования. У больных АФС антитела к этому белку вытесняют его с поверхности эндотелиоцитов и клеток трофобласта, что приводит к тромбозам сосудов плаценты и потере беременности. Антитела к аннексину V чаще выявляют при вторичном антифосфолипидном синдроме (возникающем на фоне других аутоиммунных заболеваний), соответственно, в клинической картине таких пациенток чаще встречается синдром привычного невынашивания беременности.
Антитела к тромбину – один из наиболее чувствительных тестов для диагностики антифосфолипидного синдрома. Наличие этих антител ассоциировано с развитием тромбоэмболических осложнений примерно в 70 % случаев – это самый высокий показатель среди всех маркеров АФС.
Для исследования широкого спектра антифосфолипидных антител используется метод иммунного блотинга. В его основе лежит иммунологическое взаимодействие антитела со специфичным антигеном. Выпускаемые производителем тест-системы для иммуноблота содержат нитроцеллюлозные полоски, на которых фиксированы антигены фосфолипидов и кофакторных белков. На полоску наносят исследуемую сыворотку, при наличии в ней АФЛА они связываются каждый со своим антигеном. Визуализацию образованных иммунных комплексов проводят путем добавления специального фермента и красителя. При наличии в сыворотке антифосфолипидных антител на полоске в зонах, соответствующих отдельным антигенам, появятся окрашенные полосы – так фиксируется положительный результат. Интенсивность окраски полосы можно дополнительно описывать количеством плюсов – это косвенно отражает концентрацию и аффинность (степень сродства) антител.
Для чего используется исследование?
Когда назначается исследование?
Что означают результаты?
Что может влиять на результат?
Около 5 % здоровых людей имеют повышенный титр АФЛА, чаще это лица пожилого возраста – с возрастом процент АФЛА-позитивных людей, не страдающих АФС, увеличивается. Частота выявления антифосфолипидных антител увеличивается также у больных воспалительными, аутоиммунными и инфекционными заболеваниями (сифилис, ВИЧ-инфекция, вирусный гепатит С, герпес-вирусная инфекция), злокачественными новообразованиями, а также на фоне приема некоторых лекарственных препаратов (психотропные средства, оральные контрацептивы). Таким образом, любой из лабораторных признаков при отсутствии клинических симптомов не является достаточным условием для постановки диагноза «АФС».
Помимо первичного антифосфолипидного синдрома, существует также вторичный, возникающий на фоне других заболеваний соединительной ткани. При этом у некоторых пациентов появление признаков АФС может предшествовать появлению симптомов первичного соединительнотканного заболевания (системная красная волчанка, узелковый периартериит, системная склеродермия, ревматоидный артрит). Поэтому при обследовании пациентов с предполагаемым АФС в программу диагностики следует включать определение антинуклеарного фактора в качестве скринингового теста.
Кто назначает исследование?
Гематолог, ревматолог, акушер-гинеколог, ангиохирург, пульмонолог, терапевт, врач общей практики.
Антинуклеарные антитела, иммуноблот (аутоантитела класса IgG к 14 различным антигенам: nRNP/Sm, Sm, SS-A (SS-A нативный и Ro-52), SS-B, Scl-70, Jo-1, PM-Scl, протеин B центромера, PCNA, dsDNA, нуклеосомы, гистоны, рибосомальный белок P, AMA-M2)
Описание
Антинуклеарные антитела, иммуноблот — показатель аутоиммунных заболеваний соединительной ткани.
Иммуноблот антинуклеарных антител
Иммуноблот антинуклеарных антител позволяет в одном тесте одновременно провести исследование 15 основных разновидностей антинуклеарных антител, что обеспечивает проведение дифференциальной диагностики основных системных ревматических заболеваний. Каждая разновидность аутоантител, выявляемая с помощью иммуноблота, обычно отмечается у пациентов с характерной клинической картиной, поэтому спектр аутоантител позволяет не только диагностировать заболевание, но и установить риск развития определенных клинических проявлений.
Иммуноблот антинуклеарных антител необходимо использовать на втором этапе серологического обследования при положительном результате других тестов, указывающих на присутствие в сыворотке обследуемого антинуклеарных антител.
Метод иммуноблота антинуклеарных антител в диагностике системных ревматических заболеваний характеризуется высокой клинической специфичностью. Отрицательный результат иммуноблота в этом случае не исключает диагноза системных ревматических заболеваний.
Основные заболевания, связанные с выявлением антинуклеарных антител (антигены выявляемые при иммуноблоте) :
Интерпретация результатов
Единицы измерения: качественный тест, результат представляют в форме «обнаружено» или «не обнаружено».
При обнаружении полосы, характеризующей наличие какого-либо вида антител, интенсивность окраски полосы дополнительно описывают количеством плюсов («крестов») для каждого из выявленных видов антител. Увеличение степени позитивности косвенно отражает содержание и аффинность аутоантител.
Референсные значения: антитела к Sm, RNP/Sm, SS-A (60 kДа), SS-A (52 кДа), SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, CENР-B, dsDNA, Histone, Nucleosome, Rib P, AMA-M2, Jo-1 не обнаружены.
Результат определения аутоантител представляется в «крестах» для каждого соответствующего антигена. Увеличение степени серопозитивности косвенно отражает содержание и аффинность аутоантител.
Варианты результата оценки серопозитивности приведены ниже:
Антинуклеарные антитела
Что такое «Антинуклеарные антитела»?
Антинуклеарные антитела (АНА) — это группа аутоантител (антител к своим собственным тканям), которые реагируют с компонентами ядер клеток. Известно более 100 видов этих антиядерных антител, по структуре они относятся к белкам класса иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA.
Антитела вырабатываются к нуклеиновым кислотам и различным растворимым белковым компонентам ядра: гистонам, мембране ядра, сплайсосомам, ядрышкам, центромерам и рибонуклеопротеинам.
Заболевания, при которых иммунная система реагирует на свои белки, как на чужеродные, называются аутоиммунными патологиями. Тест на антиядерные антитела назначается для их диагностики. АНА находят более, чем у 90% больных системной красной волчанкой, рассеянным склерозом, аутоиммунным гепатитом, аутоиммунным панкреатитом, первичным билиарным циррозом и другими системными заболеваниями соединительной ткани.
Большинство антинуклеарных антител образуются в ответ на разрушение клеток, когда компоненты ядер становятся доступными для распознавания иммунной системой. В норме этого не происходит, так как иммунные клетки (макрофаги) уничтожают только разрушенные клетки и не передают информацию о них лимфоцитам.
Соединение «антитело и антиген» (компонент ядра) называется иммунным комплексом. Эти комплексы откладываются в стенках сосудов и тканях органов (кожа, почки, мозг, суставные поверхности и др.), что вызывает воспалительную реакцию и повреждение тканей.
В некоторых случаях антинуклеарные антитела образуются при разрушении клеток из-за другой болезни (опухоли, инфекции) или под действием ряда лекарственных препаратов. Но обычно количество таких антител низкое и они не долго циркулируют в крови.
Как подготовиться к анализу
Для исследования на АНА нужна венозная кровь.
Правила подготовки к исследованию:
Показания для назначения анализа
Рекомендовать анализ АНА врач может при:
Значение результатов анализа
Тест на антинуклеарные антитела проводится в виде:
При скрининговом исследовании положительный результат говорит о наличии у пациента какого-то заболевания соединительной ткани. Этот тест проводится при первичном обращении пациента. При отрицательном результате полностью исключить аутоиммунный процесс невозможно.
Иммуноблотинг показывает, какие виды антител преобладают, их сочетания. Такое исследование крови более сложное и дорогостоящее, но оно помогает точнее установить причину роста АНА в крови.
О чем говорит появление антинуклеарных антител в организме
Наличие антинуклеарных антител указывает на развитие в организме аутоиммунных патологий:
Менее выраженное повышение антинуклеарных антител характерно для: